IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) dia analogue ny substrate β-galactosidase, izay tena inducible.Eo ambanin'ny fampidirana ny IPTG, ny inducer dia afaka mamorona sarotra miaraka amin'ny proteinina repressor, Ka niova ny conformation ny proteinina repressor, ka tsy afaka mitambatra amin'ny fototarazo kendrena, ary ny fototarazo kendrena dia aseho amin'ny fomba mahomby.Ka ahoana no tokony hamaritana ny fifantohan'ny IPTG mandritra ny andrana?Ny lehibe kokoa ve no tsara kokoa?
Voalohany, andeha hojerentsika ny fitsipiky ny fampidirana IPTG: Ny operon (singa) laktose E. coli dia misy fototarazo ara-drafitra telo, Z, Y, ary A, izay mandika ny β-galactosidase, permease, ary acetyltransferase.Ny lacZ dia mamadika ny laktose ho glucose sy galactose, na ho allo-lactose;Ny lacY dia mamela ny laktose ao amin'ny tontolo iainana mandalo amin'ny fonon'ny sela ary miditra ao amin'ny sela;Ny lacA dia mamindra ny vondrona acetyl avy amin'ny acetyl-CoA mankany amin'ny β-galactoside, izay misy ny fanesorana ny voka-dratsiny.Fanampin'izany, misy filaharana miasa O, filaharana fanombohana P ary générie regulateur I. Ny code gene I dia proteinina famoretana izay afaka mifatotra amin'ny toerana O amin'ny filaharan'ny opérateur, ka ny operon (meta) dia voatsindry ary tapaka.Misy ihany koa ny toerana mamatotra ho an'ny catabolic gene activator protein-CAP mamatotra toerana ambony ny fanombohana filaharana P. Ny P sequence, O sequence sy ny CAP mifamatotra toerana dia ahitana ny faritra mifehy ny lac operon.Ny fototarazon'ny anzima telo dia fehezin'ny faritra manara-dalàna iray ihany mba hahazoana ny fanehoana mirindra ny vokatry ny fototarazo.
Raha tsy misy lactose, ny lac operon (meta) dia ao anatin'ny toetry ny famoretana.Amin'izao fotoana izao, ny lac repressor asehon'ny filaharana I eo ambany fanaraha-mason'ny filaharan'ny mpanentana PI dia mifamatotra amin'ny filaharan'ny O, izay manakana ny polymerase RNA tsy hifatotra amin'ny filaharana P ary manakana ny fanombohan'ny transcription;rehefa misy ny laktose dia azo idirana ny lac operon (meta) Amin'ity rafitra operon (meta) ity, ny tena inducer dia tsy lactose mihitsy.Ny laktose dia miditra ao amin'ny sela ary notarihin'ny β-galactosidase mba hiova ho allolactose.Ity farany, toy ny molekiola inducer, dia mifamatotra amin'ny proteinina repressor ary manova ny fiovaovan'ny proteinina, izay mitarika amin'ny fisarahana ny proteinina repressor avy amin'ny filaharana O sy ny fandikana.Isopropylthiogalactoside (IPTG) dia manana fiantraikany mitovy amin'ny allolactose.Izy io dia tena mahery vaika inducer, izay tsy metabolized amin'ny bakteria ary tena miorina mafy, noho izany dia be mpampiasa any amin'ny laboratoara.
Ahoana ny fomba hamaritana ny fifantohana tsara indrindra amin'ny IPTG?Raiso ho ohatra ny E. coli.
Ny tadin'ny E. coli BL21 izay misy ny pGEX recombinant tsara (CGRP / msCT) dia natsipy tao anaty ranon-javatra LB misy 50μg · mL-1 Amp, ary nokolokoloina nandritra ny alina tamin'ny 37 ° C.Ny kolontsaina etsy ambony dia natsipy tao anaty tavoahangy 10 tavoahangy 50mL vaovao LB misy 50μg · mL-1 Amp amin'ny tahan'ny 1: 100 ho an'ny kolontsaina fanitarana, ary rehefa ny sanda OD600 dia 0.6 ~ 0.8, dia nampiana IPTG ny fifantohana farany.Izany dia 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Taorian'ny induction amin'ny hafanana mitovy sy amin'ny fotoana iray ihany, 1 mL ny bakteria vahaolana nalaina avy aminy, ary ny bakteria sela dia nangonina amin'ny alalan'ny centrifugation ary iharan'ny SDS-PAGE mba hamakafaka ny fiantraikan'ny isan-karazany IPTG concentrations amin'ny fanehoana proteinina, ary avy eo safidio ny fifantohana IPTG miaraka amin'ny fanehoana proteinina lehibe indrindra.
Aorian'ny andrana dia ho hita fa tsy dia lehibe araka izay azo atao ny fifantohan'ny IPTG.Izany dia satria ny IPTG dia manana poizina amin'ny bakteria.Ny mihoatra ny fifantohana dia hamono ny sela ihany koa;ary amin'ny ankapobeny, manantena izahay fa ny proteinina kokoa levona aseho ao amin'ny sela, ny tsara kokoa, fa amin'ny toe-javatra maro, rehefa avo loatra ny fitanan'i IPTG, dia hiforona be dia be ny fampidirana.Vatana, fa ny habetsaky ny proteinina mety levona nihena.Noho izany, ny fifantohana IPTG mety indrindra dia matetika tsy ny lehibe kokoa ny tsara kokoa, fa ny ambany kokoa ny fifantohana.
Ny tanjon'ny induction sy ny fambolena ny strains génétique dia ny hampitombo ny vokatra proteinina kendrena ary hampihenana ny fandaniana.Ny fanehoana ny fototarazo kendrena dia tsy misy fiantraikany amin'ny anton-javatra manokana sy ny fitenenana plasmid ihany, fa koa amin'ny toe-javatra ivelany hafa, toy ny fifantohana amin'ny inducer, ny mari-pana induction ary ny fotoana induction.Noho izany, amin'ny ankapobeny, alohan'ny hanehoana sy hodiovina ny proteinina tsy fantatra, dia tsara ny mandinika ny fotoana induction, ny mari-pana ary ny fifantohana IPTG mba hisafidianana ny fepetra mety sy hahazoana ny vokatra andrana tsara indrindra.
Fotoana fandefasana: Dec-31-2021